مروری بر توالی یابی نسل بعدی

توالی یابی DNA به معنای یافتن ترتیب دقیق نوکلئوتیدهاست که توسط تجهیزاتی انجام می شود که نمونه DNA را می خواند و یک فایل الکترونیکی تولید می کند. این فایل حاوی نمادهایی است که نشان دهنده ترتیب بازهای نیتروژنی A، C، G، T موجود در نمونه است.

اولین روش تعیین توالی DNA توسط Maxam-Gilbert ایجاد شد ولی کارایی بالایی نداشت و تنها قادر به تعیین توالی چند نوکلئوتید در یک زمان بود. سپس در سال 1977 روش توالی یابی دیگری توسط Frederik Sanger توسعه یافت که تا به امروز در مراکز تحقیقاتی در سراسر جهان مورد استفاده قرار گرفته می گیرد. روش توالی یابی Sanger به عنوان تکنولوژی نسل اول (first generation) محسوب می شود و برای توالی یابی قطعات DNA  با طول 500-900 جفت باز به کار می رود. به عنوان مثال، توالی یابی Sanger به طور گسترده برای تعیین توالی موجوداتی که دارای توالی های DNA کوتاه هستند، مانند پلاسمیدهای باکتریایی و یا همچنین قطعات DNA تکثیر شده توسط PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) استفاده می شود.در سال های 1986 و 1998، اولین دستگاه های توالی یابی اتوماتیک راه اندازی شدند و انجام پروژه های توالی یابی بزرگ، مانند پروژه کامل ژنوم انسانی را امکان پذیر کردند. با این حال، این پروژه با سال ها تحقیق و تلاش بین المللی و هزینه میلیاردها دلار انجام شد. 

با وجود موفقیت در تعیین توالی ژنوم کامل انسان، توالی یابی Sanger یک روش گران قیمت و ناکارآمد برای پروژه های بزرگ است. 

توالی یابی نسل بعدی (NGS)

توالی یابی نسل بعدی که توالی یابی با توان بالا نیز نامیده می شود، به روش های توالی یابی مدرن اشاره دارد که می‌توانند تا میلیاردها قطعه DNA را همزمان بخوانند. در مقایسه با توالی‌یابی Sanger، روش های نسل بعدی امان توالی‌یابی مقادیر زیاد DNA را با سرعت بالا و هزینه کم ممکن می‌سازند. اما بر خلاف روش Sanger، روش NGS قطعات کوتاه DNA را توالی‌بندی می‌کند که معمولاً از 50 تا 300 نوکلئوتید طول دارند.

پلتفرم های NGS تجهیزاتی هستند که توالی یابی در آنها انجام می شود. پلتفرم های اصلی NGS عبارتند از:

پلتفرم Roche/454: پلت فرم پیشگام در NGS است که در سال 2005 راه اندازی شد. این پلت فرم از روش Pyrosequencing استفاده می کند که اساس آن تشخیص پیروفسفات آزاد شده در طی اضافه شدن یک نوکلئوتید جدید در رشته DNA تازه سنتز شده می باشد. این روش می تواند حدود 1 میلیون خوانش را در هر آزمایش انجام دهد.

پلتفرم Ion Torrent: این پلت فرم از روشی مشابه روش Roche استفاده می کند، با این حال اضافه شدن نوکلئوتیدها از طریق تولید یون هیدروژن در طی سنتز رشته جدید شناسایی می شود. در واقع آزاد شدن یون های هیدروژن در طی فرآیند، pH محیط را تغییر و ولتاژ مثبت بالایی را ایجاد می کند که توسط دستگاه تشخیص داده می شود.

پلتفرم Illumina: این روش محبوب ترین پلتفرم توالی یابی نسل بعدی است زیرا می تواند توالی یابی را با کیفیت بالا و قیمت مقرون به صرفه تر انجام دهد. پلتفرم Illumina از توالی یابی به روش سنتز استفاده می کند. در این فرآیند نوکلئوتیدهای تغییریافته (دارای برچسب فلورسنت و یک پایان‌دهنده برگشت‌پذیر) استفاده می شوند و نوکلئوتیدها به طور همزمان به زنجیره اسید نوکلئیک اضافه و شناسایی می شوند. 

پلتفرم Solid: این پلت فرم بر اساس روش توالی یابی ligation است که از حساسیت عدم تطابق DNA لیگاز برای تعیین توالی نوکلئوتیدها در یک قطعه استفاده می کند.

به طور کلی توالی یابی نسل بعدی (NGS) درک ما از سیستم های بیولوژیکی را متحول کرده و تغییری شگرف در مطالعات ژنومیک و زیست‌شناسی مولکولی ایجاد کرده است.